SNP基因分型/基因突变检测技术                        SNP基因分型服务

Sequenom MassARRAY原理简介

美国Sequenom公司MassARRAY SNP基因分型技术是基于飞行质谱的分型技术。首先通过PCR将跨越SNP位点的DNA序列扩增出来,然后应用单一延伸引物(extension primer)扩增PCR产物。设计延伸引物时,要求引物的3‘末端距离SNP位点只有一个碱基。进行延伸反应时使用双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),以确保延伸引物只延长一个碱基。延伸产物用飞行质谱(TOF, time of flight)进行分析。虽然一个碱基的分子量差别很小,但应用特别设计的飞行质谱足以根据这微小差别进行分型。

MassARRAY的优势是可以进行多重SNP分型,即一个反应可同时分型多个SNP位点。该技术在分析数百上千个样品的数十上百个SNP时具有价格优势。缺点是仪器昂贵。

等位基因专一性PCR(AS-PCR)原理简介

等位基因专一性PCR的原理是根据SNP位点设计某一等位基因专一性引物,使得PCR只扩增某一个等位基因。举例说明,等位基因1和等位基因2 在SNP位点分别为C和T,设计引物时,扩增等位基因1和2的引物分别按照C或T设计,另一引物相同。在最理想情况下,扩增等位基因1的引物不能扩增等位基因2,反之亦然。但实际上由于基因专一性引物只在SNP位点相差一个碱基,二者都可能存在非特异性交叉扩增,即设计扩增等位基因1的引物可以扩增等位基因2,反之亦然。但多数情况下错配扩增的效率比完全互补扩增的效率低。通过在SNP位点外引人额外的错配或优化PCR反应体系,可以进一步增大两者扩增效率的差别。传统的等位基因专一性PCR通过凝胶电泳来分析PCR产物,进而确定基因型。这种方法虽然经济,但出错率高。应用实时荧光PCR进行等位基因专一性PCR,分型准确。

HRM技术原理简介

HRM技术,即高分辨率熔解曲线分析技术 (high resolution melting curve analysis),是应用高分辨率的荧光染料在饱和浓度下对PCR产物进行熔解曲线分析,通过Tm值和熔解曲线的特征形状,确定SNP基因型,或基因突变。下图示意A->C突变的HRM分析结果。杂合子A/C的熔解曲线可以清晰地与纯合子A/A 和C/C分开(左图)。纯合子A/A 和C/C熔解曲线区别很小,通过图形处理,二者的区别也显而易见(右图)。熔解曲线分析技术诞生已久,但传统的熔解曲线分析技术因为分辨率低,没有用于基因突变检测和SNP分型。高分辨率熔解曲线分析技术可以分辨一个碱基的区别,已开始用于基因突变检测和SNP分型。几方面技术的进步提升了熔解曲线分析的分辨率。一是高分辨率荧光染料的发现。与传统的荧光染料不同,这些高分辨率荧光染料对DNA聚合酶的抑制作用很小,因而可以在饱和浓度下使用。这就解决了传统荧光染料在低浓度使用时由于与双链DNA解离后又在DNA分子别处结合上去,导致熔解曲线峰很宽,分辨率很低的问题。二是精密荧光PCR仪的使用。这些精密荧光PCR仪,温度控制精密,步距小,而且反应孔位之间温差很小。三是熔解曲线处理软件的进步。先进的高分辨率熔解曲线处理软件通过数据转换去伪存真,让单碱基变化造成的熔解曲线的微小变化显示出来。


                                           


要将HRM技术成功用于基因突变检测和SNP分型,除了需要满足以上提到的三个要素外(使用饱和浓度的高分辨率荧光染料,高精密度PCR仪,和卓越的分析软件),还需要精心设计引物,尽量拉开不同基因型的熔解曲线区别;优化反应体系,使得体系和不同样本对熔解曲线的影响最小化。


应用HRM方法分析成百上千个样本的几个SNP位点,具有价格优势。

PCR-限制性内切酶片段多样性(PCR-RFLP)原理简介

PCR-RFLP方法只适应那些由于SNP位点的存在导致酶切位点变化的SNP的分型。首先通过PCR将跨越SNP位点的DNA片段扩增出来,然后用可以区分SNP位点的一个限制性内切酶酶切PCR产物。应用凝胶电泳或毛细管电泳分析酶切产物,根据酶切图谱确定基因型。

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